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本试剂盒是专门针对于illumina高通量测序平台所优化的DNA文库构建试剂盒。本制品可将经超声处理、化学处理、酶处理的片段化双链DNA或小片段DNA的末端修复和3'端dA尾添加在一管内一步法完成，同时所得产物无需纯化，可直接用于adapter的连接。

• DNA片段化过程和PCR富集过程不存在碱基偏好性，测序均一度好。
  
• 高文库转化效率，DNA样本起始量可低至1ng。
  
• 一管式酶促反应，操作简便，省去多步纯化步骤，整个建库流程仅需2.5小时。

• 操作过程请注意避免核酸样品和产物之间的交叉感染。
  
• 请使用不含RNase和DNase的枪头、EP管进行试验。
  
• 试验开始前，请清洁操作台，并使用RNase及DNA清除试剂（如RNase Away）处理台面。确保没有RNase和DNA污染。
  
• 进行文库扩增前，请确保PCR仪已经调试好并处于稳定的状态。
  
• 试验前请仔细阅读说明书，如果需要暂停试验，或者无需立即进行下游试验。可根据说明书推荐将试验产物保存于-20℃并安排后续试验。
  
• 由于使用本制品所进行的片段化过程为酶促反应，故片段化过程对反应温度、反应时间、体系配制以及DNA上样量等因素较为敏感。强烈推荐用户按照本说明书所述步骤及优化的反应参数(如反应时间等)进行试验。

• 试验准备：
  
  • 在开始试验前，需要明确核酸的浓度以及DNA需溶解于哪种溶剂中。
    注：确定上样DNA浓度至关重要，尤其在上样量低于100ng时。推荐使用Qubit、Picogreen或者其他染料法对DNA浓度进行准确定量。另外，请确认DNA溶于哪种溶剂，溶剂不同，则采用的处理方式也略有不同。
    
  • 将各试剂置于冰上，5×FEA enzyme Mix融化后用手指轻弹后混匀，不要涡旋。其余试剂可短暂涡旋混匀。
  
  
• 试验步骤：
  
  • 当DNA溶解于去离子水、10mM Tris、Buffer EB或0.1×TE中，请使用如下步骤进行片段化/末端修复/A尾添加反应。
    
    • 按下表设置PCR仪反应程序。开启热盖，热盖温度设置为70℃。
      

      反应步骤	反应温度	反应时间
      1	4℃	1min
      2	32℃	3～24min
      3	65℃	30min
      4	4℃	保持

      注：确切的片段化反应时间需要根据DNA的实际上样量进行优化。下面表1中列出了10ng、100ng和1000ng上样量DNA片段化所需的时间，用户可以参照此时间调整自己的实验。调整过程中，我们推荐额外设置一个反应时间延长3min以及一个缩短3min的对照。这样有助于确定切割至所需片段大小时所需要的准确反应时间。关于片段化时长的更多建议，请参考我司产品DNA片段化/末端修复/加dA尾试剂(Illumina)(货号：WH0208)说明书。
      表1．片段化时间选择表
      

      DNA主峰大小	片段化时间(min)(32℃)
      	250bp	350bp	450bp	550bp
      10ng DNA上样量	24	16	14	10
      100ng DNA上样量	16	10	8	6
      1000ng DNA上样量	14	8	6	4

    • 请按下表配制反应体系，冰上操作，各成分加入后，请轻柔吸打混匀，注意不要涡旋。
      

      成分	用量
      	DNA上样量≥10ng	DNA上样量＜10ng
      10×FEA Reaction Buffer	5	5μL
      DNA样本	X	X μL
      FEA Enhancer	0	2.5μL
      Nuclease-Free ddH2O	(35-X)μL	(32.5-X)μL
      总体积	40μL	40μL

      注：对于多个反应，请计算所需试剂的总体系并在此基础上增加体系10%，以避免因溶液转移过程中因挂壁损失而造成分装反应数不足的问题。
      
    • 取1个新的200μL薄壁管置于冰上，向管中加入10μL 5×FEA Enzyme Mix，随后将步骤b中反应体系转移40μL至同一薄壁管中，轻柔吸打混匀10次。
      
    • 瞬时离心薄壁管，立刻置于已预冷至4℃的PCR仪中，并启动反应程序。
      
    • 当反应程序结束后，将薄壁管从PCR仪中取出并置于冰上。
      
    • 立即进入接头连接步骤。
  • 当DNA溶解于1×TE溶液中时，请参照以下步骤进行DNA的片段化／末端修复/A尾添加反应。
    
    • 按下表设置PCR仪反应程序。开启热盖，热盖温度设置为70℃。
      

      反应步骤	反应温度	反应时间
      1	4℃	1min
      2	32℃	5～35min
      3	65℃	30min
      4	4℃	保持

      注：反应时间需根据DNA的实际上样量进行优化。若DNA上样量≥10ng，反应体系中加入2.5μL FEA Enhancer，推荐使用25min作为起始反应时间，此时产生的片段主要集中于300～500bp；若DNA上样量＜10ng，反应体系中加入5μL FEA Enhancer，则推荐使用15min作为起始时间，此时片段集中于300bp。若需要进行调整，则请以3min为单位，在原反应时间基础上进行增减，直至得到所需要的片段大小。
      
    • 请按下表配制反应体系，冰上操作，各成分加入后，请轻柔吸打混匀，注意不要涡旋。
      

      成分	用量(μL)
      	DNA上样量≥10ng	DNA上样量＜10ng
      10×FEA Reaction Buffer	5	5
      DNA样本	X	X
      FEA Enhancer	2.5	5
      Nuclease-Free ddH2O	(32.5-X)	(30-X)
      总体积	40	40

      注：对于多个反应，请计算所需试剂的总体系并在此基础上增加体系10%，以避免溶液转移过程中因挂壁损失而造成分装反应数不足的问题。
      
    • 取1个新的200μL薄壁管置于冰上，向管中加入10μL 5×FEA Enzyme Mix，随后将步骤b中反应体系转移40μL至同—薄壁管中，轻柔吸打混匀10次。
      
    • 瞬时离心薄壁管，立刻置于已预冷至4℃的PCR仪中，并启动反应程序。
      
    • 当反应程序结束后，将薄壁管从PCR仪中取出并置于冰上。
      
    • 立即进入接头连接步骤。
  • 当DNA溶解于其他溶液中时，请确定溶液中的盐离子，尤其EDTA的浓度。EDTA对反应影响较大，如果不确定溶液中EDTA浓度或EDTA浓度较高，推荐使用DNA分选纯化磁珠(货号：WH0199)对DNA进行纯化。纯化步骤如下：
    
    • 将磁珠置于室温平衡20min。
      
    • 若DNA溶液体积＜50μL，请用无核酸酶的去离子水补足体积至50μL。
      
    • 加入1.8×体积(90μL)完全涡旋混匀的磁珠至DNA溶液中，吸打混匀10次。若DNA溶液体积大于50μL，请根据DNA溶液的实际体积，加入1.8×体积完全涡旋混匀的磁珠。
      
    • 室温孵育5min后，将反应管置于磁力架上5min。待磁珠完全贴壁后，用移液器小心吸弃上清。
      
    • 将反应管置于磁力架上，用200～500μL (没过磁珠即可） 80%乙醇（现用现配）洗涤磁珠，用移液器轻轻吹打3～5次（不要吹散磁珠）。磁力架上静置30sec后，用移液器小心吸弃上清。
      
    • 重复此洗涤步骤一次。
      
    • 将反应管置于磁力架上，打开离心管盖于室温条件下晾置5～10min或至磁珠干燥为止。
      注：不要过分干燥磁珠，否则会降低得率。
      
    • 将PCR管从磁力架中取出，加入32.5μL 10mM Tris-HCl (pH8.0)进行洗脱，使用移液器吹打充分混匀10次。室温静置5min后，置于磁力架上5min，待磁珠完全贴壁后，转移约30μL上清至新的离心管中。
      
    • 使用Quibit、Picogreen或其他荧光定量方法测定纯化后的DNA浓度。

• 片段化／末端修复/A尾添加反应结束以后，向此50μL反应体系中加入Y μL的adapter溶液，轻柔吸打混匀后置于冰上。
  注：本试剂盒中不含测序DNA adapter，请参考接头供应商提供的使用条件。推荐使用单索引接头(Illumina)(货号：WH0206)，为了达到较高的连接效率，我们推荐反应体系中DNA片段与adapter的摩尔比在1:200至1:10之间。
  
• 按照下表所示各成分用量配制反应体系，并将配制完成的反应体系轻柔混匀后置于冰上。
  

  成分	用量
  5×ligation Buffer	20μL
  BalbSeq DNA Ligase	10μL
  Nuclease-Free ddH20	(20-Y)μL
  总体积	(50-Y)μL

• 将此配制好的(50-Y)μL连接反应液加入至第1步准备的反应液中，轻柔吸打混匀10次后置于预设温度为20℃的金属浴或PCR仪中反应15min。
  注：此步骤如果使用PCR仪进行反应，PCR仪热盖温度设定为≤40℃。
  
• 接头连接产物的纯化推荐使用DNA分选纯化磁珠(货号：WH0199)，向反应产物中加入1×体积(100μL)磁珠进行纯化，具体步骤如下：
  
  • 将磁珠置于室温平衡20min。
    
  • 涡旋使磁珠充分悬浮，加入100μL磁珠至步骤3连接产物中，充分吸打混匀10次。
    
  • 室温孵育5min后，将反应管置于磁力架上5min。待磁珠完全贴壁后，用移液器吸弃上清。
    
  • 将反应管置于磁力架上，用200～500μL (没过磁珠即可） 80%乙醇（现用现配）洗涤磁珠，用移液器轻轻吹打3～5次（不要吹散磁珠）。磁力架上静置30sec后，用移液器小心吸弃上清。
    
  • 重复此洗涤步骤—次。
    
  • 将反应管置于磁力架上，打开离心管盖于室温条件下晾置5～10min或至磁珠干燥为止。
    注：不要过分干燥磁珠，否则会造成得率降低。
    
  • 将PCR管从磁力架中取出，加入22.5μL 10mM Tris-HCl (pH8.0)进行洗脱，使用移液器吹打充分混匀10次。室温静置5min后，置于磁力架上5min，待磁珠完全贴壁后，转移约20μL上清至新的离心管中，用于后续的PCR富集实验。
    注：如果连接产物无需进行PCR富集，可在步骤g中加入12.5μL的10mM Tris-HCl(pH8.0)洗脱DNA，并转移10μL纯化后的DNA用于后续的试验反应。如不立即使用，请将样品冻存于-20℃保存。
    
  • 如进行DNA长度分选，加入102.5μL无核酸酶去离子水进行洗脱。并转移约100μL上清至新的离心管中，用于后续的DNA片段长度分选。
• DNA长度片段分选操作步骤：DNA长度片段分选操作步骤：DNA片段长度的分选推荐使用DNA分选纯化磁珠(货号：WH0199)，请参考表2中两步筛选过程中的磁珠添加比例进行操作。如果使用其它磁珠，请按照磁珠说明书推荐的分选比例进行操作。
  表2．片段分选推荐磁珠用量
  

  文库参数		磁珠添加比例
  初始片段大小	连接接头后 片段大小	第一次 筛选比例	第二次 筛选比例
  250bp	370bp	0.6×	0.1×
  300bp	420bp	0.55×	0.1×
  350bp	470bp	0.53×	0.1×
  400bp	520bp	0.5×	0.1×
  450bp	570bp	0.47×	0.1×
  500bp	620bp	0.45×	0.1×

  以插入片段大小为250bp的情况为例，使用磁珠进行纯化，具体步骤如下：
  
  • 将磁珠置于室温平衡20min。
    
  • 涡旋使磁珠充分悬浮，按表2第一次筛选比例加入0.6×体积(60μL)磁珠至100μL纯化体系中，充分吸打混匀10次。
    
  • 室温孵育5min后，将反应管置于磁力架上5min。待磁珠完全贴壁后，用移液器小心转移上清液至一个新的含有0.1×体积(10μ1)磁珠的离心管中并立即吹打混匀至少10次。转移上清时注意不要吸到磁珠。
    
  • 室温孵育5min后，将反应管置于磁力架上5min。待磁珠完全贴壁后，用移液器吸弃上清。
    
  • 将反应管置于磁力架上，用200～500μL (没过磁珠即可） 80%乙醇（现用现配）洗涤磁珠，用移液器轻轻吹打3～5次（不要吹散磁珠）。磁力架上静置30sec后，用移液器小心吸弃上清。
    
  • 重复此洗涤步骤一次。
    
  • 将反应管置于磁力架上，打开离心管盖于室温条件下晾置5～10min或至磁珠干燥为止。
    注：不要过分干燥磁珠，否则会降低得率。
    
  • 将PCR管从磁力架中取出，加入22.5μL 10mM Tris-HCl (pH8.0)进行洗脱，使用移液器吹打充分混匀10次。室温静置5min后，置于磁力架上5min，待磁珠完全贴壁后，转移约20μL上清至新的离心管中，用于后续的PCR富集实验。

• 将2×HiFi PCR MasterMix和P5/P7 Primers Mix (10μM each)置于冰上融化，2×HiFi PCR MasterMix轻弹颠倒混匀，P5/P7 Primers Mix (10μM each)可短暂涡旋混匀。
  
• 按下表设置PCR仪反应程序，开启热盖，温度设置于105℃。
  

  步骤	温度	时间	循环数
  1	98℃	2min	1
  2	98℃	20sec	6～12
  3	60℃	30sec
  4	72℃	30sec
  5	72℃	1min	1
  6	4℃	保持温度	1

  注：请根据DNA的质量和上样量确定PCR循环数。一般而言，对于100ng、10ng、1ng文库起始DNA，在进行PCR富集时分别需要扩增6、10、12个循环。如果在PCR富集之前经过片段大小分选步骤(size-selection)，则建议在原有基础上再增加2～4个循环；如果DNA质量较差(比如提取FFPE样品)，建议在原有基础上再增加1～3个循环。
  
• 按照下表配制PCR体系，注意此步骤需于冰浴中操作。
  

  成分	用量
  2×HiFi PCR MasterMix	25μL
  P5/P7 Primers Mix(10μM each)	5μL
  总体积	30μL

• 将纯化后的带有adapter的文库连接产物20μL转移至PCR管中，加入30μL步骤3中配制好的PCR反应液，轻柔吸打10次混匀。
  注：配制反应体系时，请全程将反应管置于冰上进行操作。
  
• 瞬时离心后将PCR反应管置于PCR仪内，按步骤2反应程序进行扩增。
  
• 当PCR样品温度降至4℃，将PCR产物取出并使用1×体积(50μL)DNA分选纯化磁珠(货号：WH0199)进行纯化。
  
  • 将磁珠置于室温平衡20min。
    
  • 涡旋使磁珠充分悬浮，加入50μL磁珠至PCR产物中，充分吸打混匀10次。
    
  • 室温孵育5min后，将反应管置于磁力架上5min。待磁珠完全贴壁后，用移液器小心吸弃上清。
    
  • 将反应管置于磁力架上，用200～500μL (没过磁珠即可） 80%乙醇（现用现配）洗涤磁珠，用移液器轻轻吹打3～5次（不要吹散磁珠）。磁力架上静置30sec后，用移液器小心吸弃上清。
    
  • 重复此洗涤步骤一次。
    
  • 将反应管置于磁力架上，打开离心管盖于室温条件下晾置5～10min或至磁珠干燥为止。
    注：不要过分干燥磁珠，否则会造成得率降低。
    
  • 将PCR管从磁力架中取出，加入22.5μL 10mM Tris-HCl (pH8.0)进行洗脱，使用移液器吹打充分混匀10次。室温静置5min后，置于磁力架上5min，待磁珠完全贴壁后，转移约20μL上清至新的离心管中。
• 上机测序前可使用凝胶电泳、qPCR定量或者Agilent生物分析仪对DNA文库质量进行鉴定。纯化后得到的DNA文库可保存于-20℃。